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科學(xué)的『支原體標(biāo)準(zhǔn)品』使用方法,讓檢測結(jié)果更靈敏

更新時間:2024-04-29  |  點(diǎn)擊率:349

《歐洲藥典》第2.6.7章(EP 2.6.7)以及《日本藥典》第G3章(JP G3),詳細(xì)描述了如qPCR等方法、基于核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAT)的支原體檢測。這些藥典中指出,如果需要用NAT法替代傳統(tǒng)方法,要求顯示每毫升樣品體積(CFU/ml)10個菌落形成單位的檢測,即靈敏度達(dá)到10CFU/ml。這種靈敏度驗(yàn)證是方法驗(yàn)證的一條必經(jīng)之路。

 

然而,由于一些細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室、研究機(jī)構(gòu)、生產(chǎn)線不配備符合支原體培養(yǎng)條件的標(biāo)準(zhǔn)化微生物實(shí)驗(yàn)室,很難實(shí)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)或處理活的、用于靈敏度測試的支原體菌落。10CFU靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品(不可逆滅活的支原體)便應(yīng)運(yùn)而生。為了保障滅活菌株的使用效果,德國Minerva Biolabs潛心研制,將先進(jìn)的凍干粉技術(shù)用于支原體檢測標(biāo)準(zhǔn)品的生產(chǎn)過程中,盡可能保障在運(yùn)輸過程中不破壞其生物活性,能夠幫助科研人員實(shí)現(xiàn)更高靈敏度的檢測驗(yàn)證。

 

產(chǎn)品雖好,但也需要配合科學(xué)的使用方法才能事半功倍。本期內(nèi)容,我們就來一起探討,支原體檢測標(biāo)準(zhǔn)品的科學(xué)使用方法。

 

一、標(biāo)準(zhǔn)品的溫度平衡

標(biāo)準(zhǔn)品在不同溫度下,可能會表現(xiàn)出不同的特性,忽略溫度平衡可能會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性。

因此,在復(fù)溶前需對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溫度平衡處理,以降低因溫度突變引起的損壞或變性的可能性,使標(biāo)準(zhǔn)品溫度逐漸接近溶解時的溫度,減少溫度變化造成的不良影響,避免基質(zhì)溫度過低導(dǎo)致凍干粉溶解困難,保證標(biāo)準(zhǔn)品在復(fù)溶過程的穩(wěn)定性和活性,提高實(shí)驗(yàn)靈敏度。

具體做法是,在復(fù)溶前,需要將標(biāo)準(zhǔn)品從2-8℃環(huán)境中轉(zhuǎn)移至室溫環(huán)境下,對其進(jìn)行溫度平衡,待所有成分與室溫一致時,才可進(jìn)行下一步操作。

 

溫度平衡好后,將標(biāo)準(zhǔn)品放入低速離心機(jī)內(nèi),短暫離心,通過旋轉(zhuǎn),將附著在管壁的凍干粉末甩至瓶底,保障復(fù)溶后物質(zhì)濃度穩(wěn)定。

 

小心打開標(biāo)準(zhǔn)品離心管,沿管壁向每個離心管中,加入經(jīng)過室溫平衡的待檢樣品的同款基質(zhì)1ml室溫孵育5分鐘。不建議用移液器反復(fù)吹打,容易造成試劑的浪費(fèi)。孵育好后,可以漩渦10,然后再低速離心機(jī)內(nèi)旋轉(zhuǎn)5秒,將管壁的液體甩下去。

 

二、支原體標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取與擴(kuò)增

滅活支原體含有一部分膽固醇和脂質(zhì),對核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)會造成不同程度的影響。因此,在檢測前,需要對支原體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行DNA提取,以純化標(biāo)準(zhǔn)品中的DNA。并去除可能存在的 PCR 抑制物質(zhì),從而提高PCR反應(yīng)的靈敏度和特異性。此外,經(jīng)過提取的支原體DNA更容易被PCR擴(kuò)增,因?yàn)榧兓蟮?span>DNA更容易與引物結(jié)合,并且不易受到來自樣品基質(zhì)的干擾。推薦使用配套的Venor®GeM Sample Preparation Kit支原體提取試劑盒(貨號:56-1010)。

根據(jù)提取試劑盒的要求,取適量標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行DNA提取,隨后再進(jìn)行正式的qPCR檢測實(shí)驗(yàn)。

 

三、支原體標(biāo)準(zhǔn)品DNA分裝與儲存

 

很多實(shí)驗(yàn)人員習(xí)慣將用不完的標(biāo)準(zhǔn)品試劑,在復(fù)溶后進(jìn)行冷藏或冷凍儲存,其實(shí)這樣的操作會在很大程度上,降低標(biāo)準(zhǔn)品的生物活性,影響檢測的靈敏度,主要影響因素有以下幾點(diǎn):

1、降低標(biāo)準(zhǔn)品的生物活性:反復(fù)凍融會導(dǎo)致支原體標(biāo)準(zhǔn)品中核酸等分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或損壞,降低了標(biāo)準(zhǔn)品的活性、影響其穩(wěn)定性。這些變化可能會在標(biāo)準(zhǔn)品的后續(xù)使用過程中,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)較大波動,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2、污染風(fēng)險增加:反復(fù)凍融會增加標(biāo)準(zhǔn)品接觸外界環(huán)境的機(jī)會,提高了諸如細(xì)菌、真菌等微生物污染,或者其他化學(xué)物質(zhì)的潛在的污染風(fēng)險。

 

因此,為了確保支原體標(biāo)準(zhǔn)品的活性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性,我們建議,盡量在復(fù)溶后將溶液一次性全部用完,以避免反復(fù)凍融帶來的潛在負(fù)面影響。

 

另外需要注意的是,在任何情況下,都不建議將使用前、還未復(fù)溶的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行冷凍保存。

相關(guān)人員的研究顯示,在2-8℃環(huán)境中,德國MB公司的凍干粉狀態(tài)穩(wěn)定,在有效期內(nèi)保存得當(dāng)?shù)那闆r下均可放心使用,是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠又穩(wěn)健的儲存方式。

如果將凍干粉置于-20℃環(huán)境下,可能會使水分重新進(jìn)入粉末中,導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品重新溶解。這個過程中,支原體標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)和活性也會受到影響,從而降低其可靠性和有效性。此外,冷凍過程中可能會引起凍融循環(huán),導(dǎo)致支原體標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性下降,影響其在實(shí)驗(yàn)中的使用效果。

 


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