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用qPCR方法檢測支原體的關(guān)鍵點(diǎn)——樣品制備

更新時間:2023-11-19  |  點(diǎn)擊率:492

qPCR(定量聚合酶鏈反應(yīng))方法在檢測細(xì)胞樣品中的支原體時具有多個優(yōu)勢:

 

高靈敏度和特異性: qPCR能夠檢測極低濃度的核酸,使其對支原體的早期檢測更為敏感。引物的設(shè)計可以確保對目標(biāo)支原體的高度特異性,減少誤報和假陽性的可能性。

 

快速性: qPCR是一種高效的方法,通常在幾小時內(nèi)就能完成。這使得可以迅速獲取支原體存在的定量信息,為及時采取措施提供了可能。

 

定量能力: 與傳統(tǒng)PCR不同,qPCR可以提供關(guān)于支原體數(shù)量的定量信息,而不僅僅是檢測是否存在。這對于評估感染的程度和追蹤治療效果非常重要。

 

自動化和高通量: qPCR可以輕松集成到自動化平臺中,實現(xiàn)高通量的樣品處理。這使得可以同時處理大量樣品,提高檢測的效率。

 

實時監(jiān)測: qPCR是實時監(jiān)測反應(yīng)的技術(shù),能夠在擴(kuò)增過程中實時測量核酸的累積量。這有助于確定PCR反應(yīng)何時進(jìn)入指數(shù)增長階段,提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

 

低檢測限: qPCR的靈敏度使其能夠檢測非常低濃度的核酸,即使在樣品中支原體數(shù)量很少的情況下也能夠可靠地檢測到。

 

綜合來看,qPCR在檢測細(xì)胞樣品中的支原體方面具有高度敏感、定量準(zhǔn)確、快速高效等優(yōu)勢,使其成為支原體研究和臨床檢測中的重要工具。

 

在進(jìn)行qPCR檢測前,需要對樣品進(jìn)行處理。在處理過程中,以下幾個關(guān)鍵點(diǎn)需要注意。

 

一般來說,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品不應(yīng)長時間放置。這可能會損害標(biāo)準(zhǔn)品的恢復(fù)。

使用的反應(yīng)容器也會對樣品DNA提取造成影響,如果沒有使用低結(jié)合核酸反應(yīng)管,DNA最終容易粘在表面。

在提取DNA之前,將200µl樣品基質(zhì)在70℃下失活10分鐘是很重要的。培養(yǎng)基及其所含的FBSPCR有抑制作用,無法檢測到標(biāo)準(zhǔn)品。

對于10cfu標(biāo)準(zhǔn)品,通過DNA提取對樣品進(jìn)行純化,對于NAT(核酸擴(kuò)增技術(shù))即傳統(tǒng)PCRqPCR的后續(xù)擴(kuò)增具有重要意義。

體積不能偏離標(biāo)準(zhǔn)推薦量。如果改變了濃度因子,則有可能樣品基質(zhì)中不包含任何標(biāo)準(zhǔn)品。

如果出現(xiàn)以上幾種可能性,則標(biāo)準(zhǔn)品或樣品沒有被檢測的效果就會被放大。


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