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不同PCR技術(shù)該怎么選?這些關(guān)鍵點(diǎn)要注意!

更新時(shí)間:2023-06-16  |  點(diǎn)擊率:751
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種重要的分子生物學(xué)技術(shù),廣泛應(yīng)用于基因分析、疾病診斷和生物學(xué)研究、生物學(xué)檢測(cè)等過(guò)程中。

隨著科學(xué)的發(fā)展,PCR的變種技術(shù)也不斷涌現(xiàn)。

本文將介紹PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR(qPCR)和數(shù)字PCR(dPCR)這三種方法的區(qū)別。
各類(lèi)PCR簡(jiǎn)介
普通PCR:
普通的PCR是一種在體外擴(kuò)增特定DNA序列的技術(shù)。它包括三個(gè)步驟:變性、退火和延伸。通過(guò)使用引物、DNA模板和DNA聚合酶,可以在熱循環(huán)過(guò)程中多次復(fù)制目標(biāo)DNA,從而快速擴(kuò)增特定片段。

qPCR:
qPCR是PCR的實(shí)時(shí)熒光變種。它通過(guò)在PCR過(guò)程中引入熒光探針,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程。這種熒光探針與目標(biāo)DNA序列的特定區(qū)域結(jié)合,當(dāng)DNA擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)增加時(shí),可以定量測(cè)量目標(biāo)DNA的存在量。

dPCR:
dPCR通過(guò)將PCR反應(yīng)分割成許多微小反應(yīng),使每個(gè)反應(yīng)中只包含少量的DNA分子。通過(guò)計(jì)數(shù)陽(yáng)性和陰性反應(yīng)的數(shù)目,可以對(duì)目標(biāo)DNA的存在進(jìn)行定量。dPCR通常使用熒光探針等來(lái)標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物。

基本原理是將稀釋后的核酸溶液,分散至芯片的微反應(yīng)器或者微滴當(dāng)中,每個(gè)反應(yīng)器僅含有微量的核酸模板數(shù)。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增之后,有一個(gè)核酸分子的模板的反應(yīng)器就會(huì)發(fā)出熒光信號(hào),沒(méi)有模板的反應(yīng)器沒(méi)有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積,可以推算出原始溶液的核酸濃度。

不同PCR技術(shù)的區(qū)別
檢測(cè)方法:PCR和qPCR都是間接檢測(cè)方法,依賴(lài)于熒光探針或染料的結(jié)合和信號(hào)產(chǎn)生。而dPCR是直接計(jì)數(shù)陽(yáng)性和陰性反應(yīng)的數(shù)目,不需要參考標(biāo)準(zhǔn)曲線或標(biāo)準(zhǔn)樣品。

定量精度:qPCR具有較高的定量精度,可以準(zhǔn)確測(cè)量目標(biāo)DNA的存在量。dPCR則具有更高的精確性和靈敏度,可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量,但對(duì)樣本量的需求較高。

靈敏度:dPCR通常比qPCR更敏感,能夠檢測(cè)低豐度的目標(biāo)DNA。

成本和復(fù)雜度:PCR和qPCR的成本相對(duì)較低,儀器設(shè)備和試劑較為普及。而dPCR需要更高的投入成本,并且設(shè)備和操作相對(duì)復(fù)雜。

樣本處理:qPCR通常需要對(duì)樣本進(jìn)行前處理,如提取和純化DNA,以獲得較好的擴(kuò)增效果。而dPCR對(duì)樣本的處理要求較低,可以直接使用復(fù)雜的樣本。


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