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qPCR技術(shù)如何在『支原體檢測』中大顯神通?

更新時間:2023-05-29  |  點擊率:628

無論是歐洲藥典、日本藥典、還是中國藥典,均對細胞相關(guān)的臨床項目有明確的支原體檢測指標(biāo)的要求。藥典中還指出,核酸法經(jīng)過方法學(xué)驗證后,可替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法與指示細胞法進行檢測。


PART.01

qPCR檢測支原體的技術(shù)原理

通過擴增高度保守的rRNA操縱子,或者更準(zhǔn)確地說,擴增支原體基因組中的16S rRNA編碼區(qū),可以特異性地檢測支原體。在FAM通道檢測支原體特異性擴增片段。在HEX通道檢測內(nèi)部擴增對照的擴增。它能特異性檢測所有導(dǎo)致細胞污染的柔膜體物種。真核DNA不會被擴增。通過內(nèi)部對照,可檢測PCR抑制劑的存在或不正確的DNA提取引起的假陰性結(jié)果。

樣本通常為細胞培養(yǎng)上清液,如檢測其他組織或細胞樣本,需要對樣本進行額外的處理,例如蛋白酶消化等過程。檢測程序通常可在3小時內(nèi)完成。


PART.02

qPCR用于支原體檢測的優(yōu)勢

快速簡便

與動輒30天起步的傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比,qPCR技術(shù)的反應(yīng)時間相對較短,通常在幾小時內(nèi)就可以完成,大大縮短了用于檢測對的時間成本。

靈敏度高

qPCR技術(shù)可以在非常低的病原體濃度下進行檢測,這種高靈敏度使得qPCR能夠有效地檢測細胞培養(yǎng)體系、實驗或生產(chǎn)流程中,是否發(fā)生支原體污染,即使在污染的早期階段,也能夠得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

并且配合靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品,進行靈敏度的驗證,進一步完善方法學(xué)驗證的流程。

以德國Minerva Biolabs公司的Venor Gem qEP為例,檢測限可達到≤10CFU/ml。

特異性強

qPCR技術(shù)可以使用特異性引物和探針來選擇性地擴增目標(biāo)支原體的DNA序列。通過設(shè)計引物和探針與目標(biāo)序列高度匹配,可以避免非特異性擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生,從而提高檢測的特異性。

以德國Minerva Biolabs公司的Venor Gem qEP為例,一次檢測即可涵蓋所有常見易感染細胞的支原體物種(包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體)。與細菌和真核DNA無交叉反應(yīng)。

定量能力

與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比,qPCR可以提供定量信息。通過利用熒光探針或DNA染料,可以實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中的熒光信號強度,從而得到目標(biāo)序列的定量結(jié)果。這種定量能力使得qPCR技術(shù)在支原體載量的測定和污染進程的監(jiān)測中非常有用。


PART.03

支原體檢測試劑盒

德國MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測試劑盒(均為探針法檢測):Venor Gem qEP,有以下優(yōu)點:

①遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性。一次檢測即可涵蓋了所有可能感染細胞的支原體物種(涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體),根據(jù)序列一致性,至少可以檢測到107種支原體物種。操作簡單,易于觀察(使用MB的試劑盒,多種支原體物種均為陽性,其他微生物或真核細胞均為陰性,無交叉反應(yīng))。

③高靈敏度。MB公司的支原體qPCR檢測試劑盒經(jīng)典法檢測限可達到≤10CFU/ml。

④各類標(biāo)準(zhǔn)品配套齊全

10CFU/100CFU的敏感度測試的標(biāo)準(zhǔn)品,便于方法學(xué)驗證。

支原體基因組DNA和細菌基因組DNA,便于特異性驗證。

支原體絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品,便于最后定量檢測。



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