細胞培養(yǎng)與內毒素

我們常說，細胞培養(yǎng)過程中，在選購血清的時候，一定要關注血清的“內毒素指標"，同時，內毒素含量也是劃分血清等級的標準之一。

(目前，由于同一廠家，不同批次的血清，內毒素數(shù)值也可能有較大差異，因此很多血清廠家在名稱上已不注明級別。但使用者仍可通過檢測報告，自行甄別挑選。)

那這血清中內毒素的高低對細胞培養(yǎng)會有啥影響??？為什么選血清要選內毒素含量低的呢？

所以今天我們就來聊聊，細胞培養(yǎng)中血清的內毒素問題。

01

人體對細菌內毒素極為敏感

極微量（1-5ng/kg，而1ng≈2.5EU）內毒素就能引起體溫上升，發(fā)熱反應持續(xù)約4小時后逐漸消退。

自然感染時，因革蘭氏陰性菌不斷生長繁殖，同時伴有陸續(xù)死亡、釋出內毒素，故發(fā)熱反應將持續(xù)至體內病原菌*消滅為止。

內毒素引起發(fā)熱反應的原因是內毒素作用于體內的巨噬細胞、中性粒細胞等，使之產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF-α等細胞因子，這些細胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調節(jié)中樞，促使體溫升高發(fā)熱。

由于內毒素是細菌死亡裂解或自溶引起的，因此環(huán)境中大量存在內毒素。但是如果在細胞培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)了大量內毒素，而細胞要用于某些疾病的治療，回輸人體，這是萬萬不行的。

02

內毒素對細胞培養(yǎng)的影響

細胞遺傳代謝的影響

此前，有人做過實驗，來觀察內毒素對細胞培養(yǎng)的影響，記錄的影響包括：刺激白細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生組織因子、激活鼠巨噬細胞，以及通過極低水平（低于 1 ng/mL）的內毒素抑制鼠類紅細胞集落形成等一系列指標。

隨后，發(fā)表了許多關于內毒素對體外細胞功能和生長影響的論文。

Morris等人發(fā)現(xiàn)（1），只需暴露 6 小時，低至 0.5 ng/mL 的內毒素水平可以增加馬腹膜巨噬細胞中IL-6的產(chǎn)生。Mattern等人發(fā)現(xiàn)（2）， 100 ng/mL 內毒素可以刺激人類 T 細胞的增殖及其淋巴因子的產(chǎn)生，但這種刺激需要與先前暴露于內毒素的單核細胞直接物理接觸。Sibley等人報道，10 到 200 ng/mL 內毒素刺激鼠 B 細胞腫瘤細胞系 (70Z/3) 完成 IgM 的產(chǎn)生，然后在細胞表面表達（3）。

從現(xiàn)有的研究可以看出，內毒素對于細胞培養(yǎng)影響還是很大的：

• 改變細胞外形

• 活化細胞，產(chǎn)生訊息傳遞物質

• 抑制酶活性

• 抑制人工受精的成功率等

血清中內毒素含量過高，更容易導致細胞“亞健康"，造成數(shù)據(jù)不準，或細胞狀態(tài)不良、老化、甚至死亡，導致試驗中斷失敗。所以要盡量選擇內毒素低的血清。

對實驗結果的影響

內毒素會加速細胞衰老、凋亡，細胞提前死亡，影響實驗結果，導致實驗數(shù)據(jù)產(chǎn)生波動。

參考文獻：

1.Morris,D.D., Crowe, N., Moore, J.N.and Moldawer, L.L. Endotoxin-Induced Production ofInterleukin 6 by Equine Peritoneal Macrophages In Vitro. Am. J. Vet. Res.53:1298-1301 (1992).

2.Mattern, T.,Thanhauser, A., Reiling, N.,Toellner, K., Duchrow, M., Kusumoto, S.,Rietschel,E.T., Ernst, M., Brade, H.,Flad, H.D. and Ulmer, A.J. Endotoxin and Lipid A StimulateProliferation of Human T Cells In the Presence of Autologous Monocytes. J.Immunol. 153:2996-3004(1994).

3.Sibley, C.H.,Terry, A. and Raetz, C.R.H.Induction of K Light Chain Synthesis in 70Z/3 BLymphoma Cells by Chemically Defined Lipid A Precursors. J. Biol. Chem.263:5098-5103 (1988).

03

選擇內毒素低的優(yōu)質血清

一般來說，細胞或組織培養(yǎng)過程中內毒素污染源通常來自于血清、培養(yǎng)液及外加藥物配制用水等。

所以選擇內毒素含量低的優(yōu)質血清就顯得尤為重要。

以下幾類情況更應關注內毒素的影響：

1、養(yǎng)干細胞時，干細胞對內毒素非常敏感，如果血清中內毒素≥3EU/ml時，干細胞很容易死亡。

2、養(yǎng)免疫細胞時，過高的內毒素可誘導免疫細胞釋放炎癥因子，抑制小鼠紅細胞集落的形成等。

3、基因敲除相關的細胞實驗，培養(yǎng)的細胞要盡可能保持其原始狀態(tài)，任何引導細胞衰老或凋亡的試劑，都會讓后續(xù)的實驗結果“失之毫厘，謬以千里"。在準備血清和其他試劑時，選擇極低的內毒素（最好≤1EU/ml），對實驗至關重要。

4、原代培養(yǎng)、雜交瘤融合、細胞轉染，或者肝細胞、神經(jīng)細胞、內皮等難養(yǎng)細胞的擴增，這些都需要挑選好的血清給細胞以有力支持。因此，挑選更低的內毒素，是保證實驗順利的第一步。

5、實驗室有些細胞，需要長期培養(yǎng)、長期凍存，或者經(jīng)常復蘇、經(jīng)常培養(yǎng)的，血清會經(jīng)?；蜷L時間作用于細胞。為保證細胞的健康，都應該選用更低內毒素的血清，以避免內毒素長久對細胞的毒性影響。

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內毒素≤3EU/ml

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