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防止實驗污染都有哪些措施?

更新時間:2022-05-18  |  點擊率:763

PCR實驗的污染來源都有:樣本間交叉污染、實驗試劑污染、擴增產(chǎn)物污染


防止實驗污染都有哪些措施?

對于低流行地區(qū),PCR檢測人員經(jīng)過嚴格培訓(xùn)上崗后,核酸污染的風(fēng)險相對較小,但在疫區(qū)超負荷工作時,就可能會遇到核酸污染的問題,可通過以下措施降低污染機會:

正確佩戴手套:手套未緊密貼合拇指、食指和中指,在進行開蓋操作時容易發(fā)生交叉污染。

正確使用生物安全柜:簡單、整潔、避免通風(fēng)口堵塞;操作前后紫外線照射,消毒劑隨手可及;廢液缸里有1/3體積的含氯消毒液,并且及時清理廢液缸,保證廢物不超過廢液缸體積的2/3。

核酸提取儀去污染:每天多批次檢測時,在每一批次檢測完以后必須用75%的乙醇和核酸去除劑對儀器進行去污染。

重視通風(fēng):不定期對房間進行通風(fēng),每次至少持續(xù)30min。

PCR擴增區(qū)去污染:PCR反應(yīng)管必須蓋緊,避免擴增后的核酸對環(huán)境的污染。

實驗室隨手可及的消毒劑。

  • 常規(guī)PCR Kit (經(jīng)典法)(不含Taq酶)

特點

1.內(nèi)控對照為獨立包裝,遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。

2.高特異性,僅一條陽性對照條帶,即可涵蓋所有可能感染細胞的支原體物種。操作簡單,

易于觀察。

3. 高靈敏度,若PCR反應(yīng)體系加入10μl樣本,支原體檢測限度為≤5或≤10CFU。

(詳見下文“(2)Venor® Gem Classic Kit 10種常見支原體檢測限“)

4.歐洲藥典要求的26種支原體均可檢出。該試劑盒可檢測出1種脲原體、7種無膽甾原體和85種支原體,與細菌和真核DNA無交叉反應(yīng)。

5.試劑盒中不含Taq酶,可另外購買。推薦使用德國MB公司專用Taq酶。(貨號: 53-1050)


Venor® Gem Classic Kit

10種常見支原體檢測限


操作步驟

第1步:樣本處理

a. 細胞培養(yǎng)上清


b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明:①樣品基質(zhì)可能會影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。

②細胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶,在低溫下也能降解支原DNA,影響檢測靈敏度。

建議:樣本做DNA抽提處理,實現(xiàn)最高靈敏度。

推薦:德國MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒,Venor® Gem Sample Preparation Kit。該DNA抽提試 劑盒已經(jīng)過廣泛驗證。

第2步:試劑制備


第3步:PCR體系建立

a. 細胞培養(yǎng)上清


b. 生物藥或需遵循藥典的樣本


第4步:啟動PCR反應(yīng)


第5步:電泳結(jié)果分析


191bp為內(nèi)控對照條帶,表明PCR反應(yīng)正常。

當樣本存在支原體污染時,由于內(nèi)控對照與支原體DNA存在競爭,內(nèi)控對照條帶變?nèi)酰ɡ缰гwDNA>103拷貝)。

陽性對照中支原體DNA>104拷貝,內(nèi)控對照條帶會*消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶,此條帶不影響檢測結(jié)果。

如果待測樣本對PCR產(chǎn)生抑制,則內(nèi)控對照條帶變?nèi)酰ê完幮詫φ障啾龋?,此時應(yīng)先進行DNA抽提(推薦使用:Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒,詳見第25頁),然后再檢測。


儲存條件

2~8℃至少6個月。復(fù)溶后在-18℃保存。


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