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您想了解細(xì)胞培養(yǎng)攻略嗎?

更新時(shí)間:2022-05-06  |  點(diǎn)擊率:739

什么是細(xì)胞傳代?

細(xì)胞傳代培養(yǎng)(subculture),當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長和細(xì)胞不斷分裂,一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制,生長速度減慢甚至停止;另一方面也會(huì)因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。

將培養(yǎng)物分割成小的部分,重新接種到另外的培養(yǎng)器皿(瓶)內(nèi),再進(jìn)行培養(yǎng)的過程被稱之為細(xì)胞傳代培養(yǎng)。對(duì)單層培養(yǎng)而言,80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。

耗材準(zhǔn)備

在實(shí)驗(yàn)開始前,需要把實(shí)驗(yàn)用品準(zhǔn)備齊全。

酒精、預(yù)熱好的*培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰酶、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿、移液器、移液管、離心管等

實(shí)驗(yàn)用的超凈工作臺(tái)需提前半小時(shí)照射紫外線。


實(shí)驗(yàn)操作

以貼壁細(xì)胞培養(yǎng)為例

1、穿好細(xì)胞房專用的實(shí)驗(yàn)服,戴好滅菌手套和口罩。

2、從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿(Tip1:一般選擇處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞),用75%酒精消毒外包裝后轉(zhuǎn)移至到超凈臺(tái)中。

3、打開蓋子(Tip2:如果是培養(yǎng)皿,只需打開一個(gè)縫隙即可,避免污染),輕輕吸出舊的培養(yǎng)液,加入適量PBS緩沖液洗滌1-2次(Tip3:注意從未培養(yǎng)細(xì)胞的側(cè)壁加入,以免沖掉細(xì)胞),棄去PBS緩沖液。

4、用移液器加入適量胰酶(Tip4:具體量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定,提前將胰酶37℃預(yù)熱,效果更好),蓋好蓋子,“十字"晃動(dòng),使胰酶充分接觸細(xì)胞。

5、將加入胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡載物臺(tái),鏡下觀察細(xì)胞消化情況,當(dāng)細(xì)胞變圓且大量脫落時(shí),準(zhǔn)備終止消化(Tip5:若初始的細(xì)胞密度比較高,加入胰酶后,肉眼也可觀察到細(xì)胞脫落,當(dāng)細(xì)胞有一半左右脫落時(shí),即可終止消化,避免反復(fù)將培養(yǎng)皿拿出超凈臺(tái),避免增加污染的風(fēng)險(xiǎn)),用75%的酒精噴灑培養(yǎng)瓶表面,轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)。

6、用移液器加入等量含血清培養(yǎng)基,終止消化。移液器充分且柔和地吹打,避免產(chǎn)生氣泡,使細(xì)胞*脫落。

7、將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中混合液體轉(zhuǎn)移至離心管中(離心管規(guī)格根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定),配平后離心3-5分鐘左右(離心機(jī)轉(zhuǎn)速根據(jù)細(xì)胞種類而定,常見的有1000-3000rpm/min)。

8、離心好后,用酒精噴壺噴灑離心管表面,轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈臺(tái),打開蓋子,將上清液倒入廢液缸。

9、加入適量體積含血清培養(yǎng)基,用移液器或巴氏吸管輕輕吹打,制成細(xì)胞懸液。

10、將細(xì)胞懸液分裝進(jìn)2個(gè)(或多個(gè))潔凈滅菌培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中,加入適量培養(yǎng)基,蓋好蓋子。

11、將分裝好的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡載物臺(tái),觀察細(xì)胞情況,細(xì)胞應(yīng)保證一定數(shù)量,數(shù)量太少會(huì)影響生長情況。

12、在培養(yǎng)瓶上做標(biāo)記,注明傳代時(shí)間,細(xì)胞種類,操作人員等信息。在放入培養(yǎng)箱之前應(yīng)再次用酒精噴一噴培養(yǎng)瓶表面,然后應(yīng)記得整理操作臺(tái),用75%酒精擦拭超凈臺(tái)臺(tái)面,清理廢液和垃圾。


科研實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞的體外培養(yǎng)一直是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞要養(yǎng)好,就要用好血清,如Ausbian®特級(jí)胎牛血清,它適合各種細(xì)胞培養(yǎng),尤其適合難養(yǎng)細(xì)胞,如:干細(xì)胞、肝細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞,原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染細(xì)胞等。


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