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細胞凋亡檢測實驗

更新時間:2022-04-27  |  點擊率:636

細胞膜是一選擇性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當細胞壞死時,質(zhì)膜不完整,PI就進入細胞內(nèi)部,它可嵌入到DNA或RNA中,使壞死細胞著色,凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質(zhì),可跨膜進入活細胞,因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱,它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合(主要結(jié)合于A-T)堿基區(qū)),顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。


一、試劑準備

1. 三尖杉酯堿(HT):300μg/ml;
2. Tris-HCl(pH7.5):100mmol/L;
3. EDTA緩沖液:5mol/L;


4. 堿性裂解液:0.2mol/L NaOH;
5. 醋酸鈉:3mol/L KAc(pH4.8);
6. PI母液:500μg/ml;
7. Ho33342母液:2mmol/L;
8. 人早幼粒白血病HL-60細胞:用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)。
9. 其他:異丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚藍、蔗糖指示劑、TBE電泳緩沖液、1%瓊脂糖、溴乙錠。

二、三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細胞凋亡

1. 實驗前約24小時,接種兩瓶HL-60細胞,標記①、②,每瓶含約6 ml培養(yǎng)液,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2. 實驗前約2.5小時,當細胞密度達到70%,①號瓶加入三尖杉酯堿200 μl,使終濃度為1 μg/ml,②號瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作對照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時。

3. Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細胞

(1)染色:將瓶中的細胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中,加入Ho33342母液2 μl,PI 20 μl,染色15分鐘。

(2)滴片:取一載玻片用雙面膠圍成一小室,從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10 μl,加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片,熒光鏡下用紫外激發(fā)光,高倍鏡下觀察,區(qū)別三種細胞,并注意三者比例。


注意事項

1. 誘導培養(yǎng)HL-60細胞時間要準確;

2. 熒光顯微鏡下觀察細胞時,由于熒光易碎滅,觀察時要盡量快。


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