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葉酸的檢測方法

更新時(shí)間:2018-09-05  |  點(diǎn)擊率:2786

近年來,葉酸對人類健康的影響越來越受重視,對葉酸檢測要求也就越來越高。由于各種樣品中成分復(fù)雜,葉酸的測定也比較復(fù)雜。葉酸含量的測定方法很多,例如:

1、液相色譜法( HPLC)

操作方法和所用藥品分析相似:稱取磨細(xì)的樣品置于離心管中,加入流動(dòng)相液體,超聲波提取15 min-30 min。取出后加入流動(dòng)相定容,搖勻后過濾,濾液用 HPLC 法分析。

液相色譜法的特點(diǎn)是測定結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便、省時(shí)省力、分析速度快、分離效果好,是近年來發(fā)展速度較快的測定葉酸的方法,分析操作方法和所用藥品分析相似,適合檢測純品,但分析成本高,液相色譜儀價(jià)格及日常維護(hù)費(fèi)用貴。

 

2、液相柱后衍生法

選用含 12%乙腈 +88% 0. 05 mmo l /L 磷酸二氫鉀溶液(pH =3.5)作為流動(dòng)相,流速 1 m l /m in, 經(jīng) ODS C - 18反相色譜柱分離, 柱溫設(shè)為 40℃,以0.5%過二硫酸鉀溶液為衍生劑,流速為0.3  mL /min, 反應(yīng)溫度為 60℃,使用熒光檢測器檢測定量,激發(fā)波長為365 nm,發(fā)射波長為 450 nm,外標(biāo)法測定葉酸含量。

本法利用葉酸經(jīng)氧化劑氧化后具有熒光特性,采用柱后衍生法熒光檢測器測定,大大提高了檢測葉酸的靈敏度(較紫外檢測提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)),避免了使用離子對試劑傷害柱子且能夠準(zhǔn)確定量,本方法簡單、快捷、靈敏,滿足日常分析要求。

 

3、同位素放射免疫法

同位素放射免疫法對多谷氨酸葉酸反應(yīng)的相對靈敏度有較大的差別,隨著葉酸濃度增加,反應(yīng)的相對靈敏度增加,但多谷氨酸葉酸的反應(yīng)曲線不可能與單谷氨酸葉酸的反應(yīng)曲線重合;另一方面,多谷氨酸葉酸與結(jié)合蛋白的親合性與單谷氨酸葉酸相比較高,不同的單谷氨酸葉酸衍生物反應(yīng)靈敏度不同,放射免疫法也不適用于檢測單谷氨酸葉酸衍生混合物。

該方法具有快速、簡便的特點(diǎn),同時(shí)由于葉酸放射免疫試劑盒的出現(xiàn),很快得到普及,尤其廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室。但放射免疫法可用于檢測和評價(jià)葉酸的營養(yǎng)狀況,從定量檢測的角度來講,難以得到準(zhǔn)確的葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)值。

 

4、微生物測定法

此方法適用于食品中葉酸含量的測定,根據(jù)細(xì)菌對葉酸的營養(yǎng)需求,在一系列不含葉酸的培養(yǎng)基中從低到高添加已知含量的葉酸以及待測的食品樣品,在37°C培養(yǎng)18h。因?yàn)橛辛巳~酸,細(xì)菌能生長得很好,培養(yǎng)液發(fā)生渾濁。細(xì)菌越多,培養(yǎng)基就越渾濁,吸光度就越高。通過已知含量的葉酸樣品的吸光度,以及待測樣品的吸光度,就能確定待測樣品中的葉酸含量。

微生物測定法的特點(diǎn)是靈敏度高,樣品中被測物量含量極低時(shí)也能被測出。樣品處理簡單,不需要一系列的提純步驟,前處理操作步驟簡單。微生物法是目前應(yīng)用為廣泛的,也是美國*分析化學(xué)家協(xié)會(huì)的推薦方法,我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于嬰幼兒食品和乳品中葉酸含量的測定,微生物法是測定葉酸的方法。

上HiMedia公司生產(chǎn)的葉酸測定用培養(yǎng)基(貨號(hào):M543),該培養(yǎng)基的特點(diǎn)是不含痕量葉酸,有效避免標(biāo)準(zhǔn)曲線偏移和本底過高,測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠,由認(rèn)證的GMP,CE和FDA,ISO9001,ISO13485等證書,成分符合《GB5009.211-2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測定》。

 

 

5、離子捕獲法

該技術(shù)是目前葉酸檢測技術(shù)中較新的研究成果,即在實(shí)驗(yàn)中,樣品加入變性劑后葉酸與內(nèi)源性結(jié)合蛋白分離,釋放后的葉酸再與帶有大量陰離子的親合試劑結(jié)合,合成產(chǎn)物經(jīng)過離子捕獲池而與陽離子纖維結(jié)合,后通過堿性磷酸酶與蝶酸(葉酸的類似物)結(jié)合物對葉酸結(jié)合蛋白上游離結(jié)合位點(diǎn)的探查,定量分析樣品中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。當(dāng)離子捕獲法測定血清或紅細(xì)胞中的葉酸時(shí),其結(jié)果與同位素放射免疫法的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

該方法主要用于臨床測定血清或紅細(xì)胞中的葉酸含量。

 

6、聚合酶鏈 - 限制性片段長度多態(tài)性測定法

聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性測定原理是擴(kuò)增產(chǎn)物用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,將PCR 產(chǎn)物純化后酶切,經(jīng)3 % 瓊脂糖凝膠電泳分析,紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察帶型,根據(jù)帶型判讀基因型。通過基因型頻率計(jì)算等位基因頻率,以Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)確認(rèn)樣本的群體代表性。

此方法檢測速度快,無離子輻射,操作簡單,可作為一般實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查和臨床應(yīng)用。

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